Технологии визуализации обещают самые глубокие исследования живой мозговой ткани с разрешением на уровне отдельных клеток
Как в исследовательских, так и в медицинских целях, исследователи десятилетиями расширяли границы возможностей микроскопии, чтобы получать всё более глубокие и чёткие изображения активности мозга, не только в коре, но и в более глубоких областях, таких как гиппокамп. В новом исследовании группа учёных и инженеров Массачусетского технологического института продемонстрировала новую микроскопическую систему, способную проникать в ткани мозга на исключительно большую глубину и обнаруживать молекулярную активность отдельных клеток с помощью звука.
«Главное достижение здесь — возможность получать более глубокие изображения с разрешением на уровне отдельных клеток», — заявила нейробиолог Мриганка Сур, соавтор, работающий вместе с профессором машиностроения Питером Со и ведущим научным сотрудником Брайаном Энтони. Сур — профессор кафедры Пола и Лайлы Ньютон в Институте обучения и памяти Пикауэра и на кафедре мозга и когнитивных наук Массачусетского технологического института.
В журнале Light: Science and Applications группа демонстрирует , что им удалось обнаружить НАД(Ф)Н — молекулу, тесно связанную с метаболизмом клеток в целом и электрической активностью нейронов в частности, — на всех образцах, таких как «церебральный органоид» размером 1,1 мм — 3D-мини- ткань, похожая на мозг , созданная из стволовых клеток человека, и срез мозговой ткани мыши толщиной 0,7 мм.
На самом деле, как заявил соавтор и постдокторант в области машиностроения У. Дэвид Ли, придумавший инновационную конструкцию микроскопа, система могла бы заглядывать гораздо глубже, но тестовые образцы были недостаточно большими, чтобы это продемонстрировать.
«Вот тогда мы и наткнулись на стекло с другой стороны», — сказал он. «Думаю, мы вполне уверены, что сможем продвинуться дальше».
Тем не менее, глубина 1,1 мм — это более чем в пять раз больше, чем позволяют другие микроскопы, способные различить НАД(Ф)Н в плотной мозговой ткани. Новая система достигла такой глубины и чёткости благодаря сочетанию нескольких передовых технологий, позволяющих точно и эффективно возбуждать молекулу и затем детектировать полученную энергию, без необходимости добавления каких-либо внешних меток, будь то химические вещества или генно-модифицированная флуоресценция.
Фотография новой многофотонной фотоакустической микроскопической системы без маркировки Массачусетского технологического института. Фотография Тацуи Осаки. Источник: Тацуя Осаки/MIT Picower Institute
Вместо того, чтобы фокусировать необходимую энергию возбуждения НАД(Ф)Н на нейроне с помощью ближнего ультрафиолетового света в области его обычного пикового поглощения, микроскоп осуществляет возбуждение, фокусируя интенсивный, чрезвычайно короткий импульс света (длительностью в одну квадриллионную секунды) на длине волны, в три раза превышающей длину волны нормального поглощения. Такое «трёхфотонное» возбуждение проникает глубоко в ткани с меньшим рассеиванием мозговой тканью благодаря большей длине волны света («как противотуманные фары», — сказал Сур).
Между тем, хотя возбуждение и создаёт слабый флуоресцентный сигнал света от НАД(Ф)Н, большая часть поглощённой энергии создаёт локальное (~10 микрон) тепловое расширение внутри клетки, что приводит к возникновению звуковых волн , которые относительно легко распространяются через ткань по сравнению с флуоресцентным излучением. Чувствительный ультразвуковой микрофон микроскопа улавливает эти волны, и при наличии достаточного количества звуковых данных программное обеспечение преобразует их в изображения высокого разрешения (подобно сонограмме). Полученное таким образом изображение называется «трёхфотонной фотоакустической визуализацией».
«Мы объединили все эти технологии — трёхфотонную фотоакустическую безметковую детектирование», — сказал соавтор Тацуя Осаки, научный сотрудник Института Пикауэра в лаборатории Сура. «Мы объединили все эти передовые технологии в единый процесс, чтобы создать платформу «многофотонного входа и акустического выхода».
Ли и Осаки совместно с исследователем Сян Чжаном и постдокторантом Ребеккой Зубайло возглавили исследование, в котором команда продемонстрировала надёжное обнаружение звукового сигнала в образцах. На данный момент команда создала визуальные изображения звука на разных глубинах, совершенствуя методы обработки сигнала.
В исследовании группа также демонстрирует одновременную визуализацию «генерации третьей гармоники», которая получается при трёхфотонной стимуляции и точно визуализирует клеточные структуры, наряду с фотоакустической визуализацией , которая обнаруживает НАД(Ф)Н. Они также отмечают, что их фотоакустический метод может обнаруживать и другие молекулы, такие как генетически кодируемый индикатор кальция GCaMP, который нейробиологи используют для сигнализации об электрической активности нейронов.
На этой отредактированной версии рисунка из исследования молекулы НАД(Ф)Н в клетках мозгового органоида обнаруживаются фотоакустически (синим цветом слева) и оптически (черно-белым цветом справа). Глубина изображения 0,2 мм. Источник: MIT
Болезнь Альцгеймера и другие приложения
Изложив в статье концепцию безметковой многофотонной фотоакустической микроскопии (LF-MP-PAM), группа теперь рассчитывает на ее применение в нейронауке и клинической практике.
Ли уже установил, что визуализация НАД(Ф)Н может помочь в лечении ран. Известно, что уровни этой молекулы в мозге варьируются при таких состояниях, как болезнь Альцгеймера, синдром Ретта и судороги, что делает её потенциально ценным биомаркером. Поскольку новая система не требует маркировки (т.е. не содержит добавленных химических веществ или изменённых генов), её можно использовать у людей, например, во время операций на головном мозге.
Следующим шагом команды станет демонстрация этого эффекта на живом животном, а не только на тканях in vitro и ex vivo. Техническая сложность заключается в том, что микрофон больше не может располагаться с противоположной стороны образца от источника света (как это было в текущем исследовании). Он должен располагаться сверху, как и источник света.
Ли заявил, что, по его мнению, полная визуализация на глубине 2 мм в живом мозге вполне осуществима, учитывая результаты нового исследования.
«В принципе это должно сработать», — сказал он.
Также читают: