Исследование подчеркивает необходимость стандартизированных методов измерения в генной терапии
В выводе, имеющем значение для одного из самых перспективных передовых методов лечения, исследователи оценили несколько методов измерения, обычно используемых в генной терапии. Исследование определило, что один из самых популярных методов был «проблемным» и требует дальнейшей разработки и стандартизации.
В генной терапии дефектные гены человека либо заменяются, либо модифицируются для лечения или профилактики заболеваний. При наличии примерно двух десятков продуктов на рынке и сотен клинических испытаний, которые проводятся или планируются, лечение приветствуют как революционный метод воздействия на основные генетические причины заболеваний, начиная от серповидноклеточной анемии и заканчивая раком.
Некоторые методы генной терапии используют модифицированные аденоассоциированные вирусы (AAV) для доставки терапевтического генетического материала в клетки пациента. Эти AAV разработаны для воздействия на определенные типы клеток. Затем их инфекционный генетический материал заменяется терапевтическим генетическим материалом, и они вводятся пациенту.
Правильное измерение векторов AAV, как их называют, имеет решающее значение для их безопасности и эффективности.
В недавно опубликованном исследовании ученые из Национального института стандартов и технологий, Национального института инноваций в производстве биофармацевтических препаратов (NIIMBL) и Фармакопеи США (USP) привлекли шесть промышленных лабораторий в США и Европе для измерения образцов векторов AAV.
Работа опубликована в журнале Human Gene Therapy .
Лаборатории попросили количественно оценить концентрацию генетического материала и вирусных частиц в векторах. Они использовали четыре метода измерения и сообщили о своих результатах авторам исследования.
Из четырех примененных методов измерения наименьшую точность и достоверность показал полимеразная цепная реакция- иммуноферментный анализ (ПЦР-ИФА). Под точностью исследователи подразумевают, насколько близко измерение к правильному значению. Точность относится к тому, дает ли метод постоянно схожие результаты.
Неточность ПЦР-ИФА привела авторов исследования к выводу, что метод имеет «плохую воспроизводимость». Его результаты не могли быть надежно воспроизведены как в одной и той же лаборатории, так и в разных лабораториях.
Сводка сообщенных значений FTT для AAV5 и AAV8, измеренных различными методами. Кредит: Human Gene Therapy (2024). DOI: 10.1089/hum.2024.124
Они добавили, что метод «не следует использовать для количественных [измерений векторов AAV] без дальнейшей разработки и гармонизации метода».
PCR-ELISA на самом деле представляет собой два отдельных инструмента, объединенных в один. PCR используется для количественной оценки генетического материала, а ELISA измеряет белки, составляющие вирусную оболочку. Оба теста существуют уже несколько десятилетий, и в настоящее время на рынке продаются десятки версий каждого из них.
В результате существуют тонкие, но важные различия в способах производства и использования ПЦР-ИФА, сказал инженер-химик NIST Уайетт Н. Вриланд. Все могут думать, что они делают одно и то же, проводя тест ПЦР-ИФА, сказал он, но часто это не так.
«Это как рецепт одного и того же шоколадного торта», — сказал Вриланд, который был главным исследователем в исследовании. «Вы можете дать кому-то одни и те же ингредиенты, но когда вы используете разное оборудование для их приготовления или выпекаете их в разных печах, торты получаются разными».
Вот что показало исследование относительно остальных трех методов:
SEC-MALS (эксклюзионная хроматография с многоугловым рассеянием света и тандемным УФ/видимым и/или рефракционным показателем) оказался наиболее точным и достоверным из протестированных методов.
SV-AUC (анализ скорости седиментации ультрацентрифугирование) с оптикой интерференции UV/Vis и/или Рэлея был менее точным и четким, чем SEC-MALS, что удивило исследователей, поскольку SV-AUC считается «золотым стандартом» для измерения вектора AAV. Однако SV-AUC был лучше, чем SEC-MALS, в создании подробной «карты» распределения генетических и вирусных частиц в векторе AAV . Исследование показало, что «SEC-MALS может быть реализован как общий метод с использованием [SV-AUC] для более полного анализа по мере необходимости».
Двухволновая ультрафиолетовая спектрофотометрия A260/A280, измеряющая поглощение ультрафиолетового света образцом, имеет существенные ограничения по сравнению с другими методами. Она не может различать частично заполненные или переполненные векторы AAV. Кроме того, частицы белка AAV слишком велики для того, чтобы оборудование могло их обработать без ошибок. Эти проблемы со спектрофотометрией хорошо документированы, и эта методика, как правило, не используется для высокоточных измерений.
Исследование не сделало выводов о прошлых, текущих или будущих исследованиях генной терапии, которые опирались на эти методы для измерения векторов AAV. Оно также не дало никаких политических или нормативных рекомендаций.
В будущей работе исследователи из NIST, USP и NIIMBL планируют разработать стандартные операционные процедуры (SOP) для SV-AUC. SOP — это подробный письменный набор инструкций для определенной технологии или методологии. Ученые полагают, что наличие широко принятых SOP для SV-AUC улучшит его воспроизводимость до того же уровня, что и у SEC-MALS, для которого уже есть SOP.
«Все различные методы, которые мы протестировали, имеют свои ограничения и неопределенности», — сказал Вриланд. «Важно понимать, что ваша методика измерения может вам сказать, а что нет».